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    • 专利摘要:
    L-Lysin wird durch Kultivieren eines methanolverwertenden Bakteriums, welches L-Methionin für sein Wachstum benötigt und die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin hat, in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, produziert, wobei L-Lysin in der Kultur hergestellt und angehäuft wird und L-Lysin aus der Kultur gewonnen wird.
    公开号:DE102004001674A1
    申请号:DE200410001674
    申请日:2004-01-12
    公开日:2004-08-12
    发明作者:Takayuki Kawasaki Asahara；Seiko Kawasaki Hirano；Hisashi Kawasaki Yasueda
    申请人:Ajinomoto Co Inc；
    IPC主号:C12N1-21
    专利说明:
    [0001] Die vorliegende Erfindung betriffteine Technik, die in der mikrobiellen Industrie nützlich ist.Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahrenzur Produktion von L-Lysin durch Fermentation.
    [0002] Kurze Beschreibung der verwandtenTechnik L-Lysin wird durch Fermentation unter Einsatz von Mikroorganismenproduziert, die zur Gattung Corynebacterium, Bacillus, Escherichiaoder dergleichen gehören (vgl. "Amino Acid Fermentation", herausgegeben vonH. Aida et al., Japan Scientific Societies Press [Gakkai ShuppanCenter], erste Ausgabe, veröffentlichtam 30. Mai 1986). Bakterienstämme,die aus der Natur isoliert wurden, oder davon abgeleitete Mutantenstämme, diebezüglichNährstoffenauxotroph sind, sind zur Verbesserung der Produktion in diesen Mikroorganismeneingesetzt worden. Außerdemsind verschiedene Techniken zur Erhöhung der Fähigkeit zur Produktion vonL-Lysin unter Einsatz rekombinanter DNA-Techniken zur Verstärkung der Aktivität von biosynthetischenEnzymen fürL-Lysin offenbart worden (WO95/16042).
    [0003] Die Produktivität für L-Lysin ist durch das Züchten vonMikroorganismen, wie solchen, die vorstehend erwähnt wurden, sowie durch Verbesserungvon Produktionsmethoden erheblich erhöht worden. Um jedoch dem erhöhten zukünftigenBedarf Rechnung zu tragen, besteht immer noch ein Bedarf an derEntwicklung eines Verfahrens, das eine effizientere Produktion vonL-Lysin bei niedrigeren Kosten bereitstellt.
    [0004] Methanol ist ein Fermentationsrohmaterial,das in großenMengen und kostengünstigzur Verfügung steht.Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation unterEinsatz von Methanol sind bekannt und umfassen Verfahren unter Einsatzvon Mikroorganismen, die zur Gattung Achromobacter oder Pseudomonas(offengelegtes Japanisches Patent (Kokai) Nr. 45-25273), Protaminobacter(Japanische Patentveröffentlichung(Kokoku) Nr. 49-125590), Protaminobacter oder Methanomonas (offengelegtesJapanisches Patent (Kokai) Nr. 50-25790), Microcyclus (offengelegtesJapanisches Patent (Kokai) Nr. 52-18886), Methylobacillus (offengelegtesJapanisches Patent (Kokai) Nr. 4-91793), Bacillus (offengelegtesJapanisches Patent (Kokai) Nr. 3-505284) Methylophilus (WO00/61723)u.s.w. gehören.
    [0005] Außerdem ist für striktMethanol verwertende Bakterien, insbesondere Methylophilusbakterien,berichtet worden, dass es schwierig ist, auxotrophe Mutanten durch übliche Verfahrenzu erhalten ((1983), Band 129, S. 785-799; M.L. O'Connor und R.S. Hanson, Journal of GeneralMicrobiology (1978), Band 104, S. 105-111). Deshalb konnte bei Versuchenzur Gewinnung von glutaminauxotrophen Stämmen beispielsweise nur ein Stammmit einer temperatursensitiven Auxotrophie erhalten werden (WindassJ. D. et al., Nature, 287, S. 396-401 (1980)). Selbst beim Einsatzeines speziellen Verfahrens, beispielsweise dem Suspendieren vonZellen in einer Lösung,die ein Mutagenisierungsmittel fürDNA enthält,und Anlegen einer Spannung an die Zellen, um in den ZellmembranenLöcherhervorzurufen und dadurch den Fluss des Mutagenisierungsmittelsin die Zellen (Elektroporation) zu ermöglichen, konnten nur drei Artenvon Mutantenstämmenerhalten werden, nämlichein folsäureauxotropherStamm, ein polyauxotropher Stamm für Serin und Alanin und einpolyauxotropher Stamm fürGlutaminsäureund Inositol (C.S. Kim und T.K. Wood, Applied Microbiol. & Biotechnology, 48,S. 105-108 (1997).
    [0006] Zusätzlich beschreibt die WO 00/61723,dass Methylophilus methylotrophus einer Mutagenisierungsbehandlungunter Einsatz eines chemischen Mutagenisierungsmittels ausgesetztwurde, um unvollständig (leaky)auxotrophe Stämmefür Casaminsäure zu erhalten,wobei dieser Stamm Valin, Leucin und Isoleucin produzierte. Angesichtsder Eigenschaften des Mutantenstammes scheint es jedoch, dass derStamm fürCasaminosäureunvollständigauxotroph wurde, weil der Wechsel in den Zellmembranen die Permeationvon verschiedenen Aminosäurenaus der Zelle in das Medium erlaubte.
    [0007] Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindungist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Effizienz der L-Lysinproduktionunter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien bereitzustellen.
    [0008] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitzustellen,welches das Kultivieren eines Methanol verwertenden Bakteriums,das L-Methionin fürsein Wachstum benötigtund L-Lysin in einem Medium produzieren kann, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält, dasAnhäufenvon L-Lysin in der Kultur und das Gewinnen des L-Lysins aus derKultur umfasst.
    [0009] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, das vorstehend beschriebene Verfahren bereitzustellen,wobei das Bakterium ein Methylophilusbakterium ist.
    [0010] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, das vorstehend beschriebene Verfahren bereitzustellen,wobei das Methylophilusbakterium Methylophilus methylotrophus ist.
    [0011] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, das vorstehend beschriebene Verfahren bereitzustellen,wobei das Methylophilusbakterium derart modifiziert ist, dass eineenzymatische Aktivitätvon Diaminopimelatsynthetase und ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
    [0012] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, ein Methylophilusbakterium bereitzustellen, welchesL-Methionin für sein Wachstumbenötigtund die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat.
    [0013] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, das vorstehend beschriebene Methylophilusbakteriumbereitzustellen, welches Methylophilus methylotrophus ist.
    [0014] Ein weiterer Gegenstand der vorliegendenErfindung ist es, das vorstehend beschriebene Methylophilusbakteriumbereitzustellen, welches derart modifiziert ist, dass eine enzymatischeAktivitätvon Diaminopimelatsynthetase ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
    [0015] Erfindungsgemäß kann die L-Lysinproduktionunter Einsatz methanolverwertender Bakterien verbessert werden.
    [0016] Die Erfinder der vorliegenden Erfindunghaben eingehende Studien durchgeführt, um die vorstehend genanntenAufgaben zu lösen.Im Ergebnis waren sie dahingehend erfolgreich, dass sie Methioninauxotrophie aufein Methanol verwertendes Bakterium übertrugen, und sie fanden,dass diese Eigenschaft die L-Lysinproduktivität aus Methanol durch das Methanolverwertende Baktrium verbesserte.
    [0017] In der vorliegenden Erfindung bedeutet "die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin" dieFähigkeiteines erfindungsgemäßen Bakteriums,die Anhäufungvon L-Lysin in einem Medium in einer signifikanten Menge, beispielsweise0,1 g/l oder mehr, zu bewirken, wenn es in dem Medium kultiviertwird, oder die Fähigkeitdes erfindungsgemäßen Bakteriums,die Menge an freiem L-Lysin in den Zellen pro Gesamtmasse der Proteinein den Zellen im Vergleich zum Wildtypstamm beispielsweise um das1,5-fache oder mehr zu erhöhen.
    [0018] Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein Methanolverwertendes Bakterium, das L-Methionin für sein Wachstum benötigt, wasauch als L-Methioninauxotrophie bezeichnet wird, und das die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat. In der vorliegenden Erfindung bedeutetein Methanol verwertendes Bakterium oder methylotrophes Bakteriumein Bakterium, das durch Verwerten von Methanol als Hauptkohlenstoffquellewachsen kann und worin die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin durch L-Methioninauxotrophie verliehenoder verstärkt werdenkann. Spezifische Beispiele umfassen Methylophilusbakterien, wieMethylophilus methylotrophus und Methylobacillusbakterien, wie Methylobacillusglycogenes und Methylobacillus flagellatum.
    [0019] Beispiele von Methylophilus methylotrophusumfassen den AS1-Stamm (NCIMB 10515) und dergleichen. Der Methylophilusmethylotrophus AS1-Stamm (NCIMB 10515) ist von den National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria erhältlich (Adresse: NCIMB Lts.,Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, VereinigtesKönigreich).
    [0020] Beispiele von Methylobacillus glycogenesumfassen den T-11-Stamm (NCIMB-11375), den ATCC 21276-Stamm, denATCC 21371-Stamm, den ATR80-Stamm (beschrieben in Appl. Micro biol.Biotechnol., 42, Seiten 67-72 (1994), den A513-Stamm (beschriebenin Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, Seiten 67-72 (1994) und dergleichen. Der Methylobacillusglycogenes NCIMB 11375-Stamm ist von den National Collections ofIndustrial and Marine Bacteria erhältlich (Adresse: NCIMB Lts.,Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, VereinigtesKönigreich).Beispiele von Methylobacillus flagellatum umfassen den KT-Stamm (beschriebenin Arch. Microbiol., 149, Seiten 441-446 (1988)) und dergleichen.
    [0021] Das Methanol verwertende Bakterium,das L-Methionin fürsein Wachstum benötigund die Fähigkeit zurProduktion von L-Lysin hat, kann unter Verwendung eines Methanolverwertenden Bakteriums, das L-Methionin nicht benötigt (nicht-auxotrophbezüglichL-Methionin), hergestellt werden. Beispiele für Methanol verwertende Bakterien,die fürihr Wachstum L-Methionin nicht benötigen, sind unter anderem Wildtypstämme von Methanolverwertenden Bakterien.
    [0022] In der vorliegenden Erfindung bedeutetder Ausdruck "benötigt L-Methioninfür seinWachstum", dass beispielsweiseein Stamm nicht wächst,wenn er in einem SEII-Medium, das L-Methionin nicht enthält odereinen L-Methioningehalt von 0,001 g/l oder weniger hat, bei 30 bis37°C während 2Tagen kultiviert wird, während er,wenn er in dem selben Medium kultiviert wird, das mindestens 0,05g/l oder mehr L-Methionin enthält,mit einer Geschwindigkeit, gemessen als Erhöhung der Masse von Zellen proZeiteinheit, wächst,die derjenigen des Wildtyps, des nichtmodifizierten Stammes oderdes Elternstammes vergleichbar ist, oder mit einer Geschwindigkeitwächst,die 5% oder mehr, vorzugsweise 20% oder mehr des Wildtyps, des nichtmodifizierten Stammesoder des Elternstammes entspricht,. Wenn ein gewünschter Stamm (auxotroph für L-Methionin)eine Kolonie mit einem Durchmesser von 1 mm oder mehr selbst dannnicht bilden kann, nachdem etwa 100 Zellen auf eine typische Plattemit SEII-Agarmedium, das L-Methionin nicht enthält, aufgetragen wurden undzwei Tage bei 37 °Ckultiviert wurden, dieser Stamm jedoch die Fähigkeit zur Bildung von Kolonienmit einem Durchmesser von 1 mm oder mehr auf dem selben Medium,das 1 g/l L-Methionin enthält,nach der Kultivierung unter denselben Bedingungen hat, wird dieserStamm zudem als einer bezeichnet, der "L-Methionin für sein Wachstum benötigt".
    [0023] Beispiele des Verfahrens zur Ableitungeines auxotrophen Stammes fürL-Methionin aus einem nichtauxotrophen Stamm für L-Methionin umfassen dasBehandeln eines nichtauxotrophen Stammes für L-Methionin mit einer physikalischenStimulation, die ein Gen mutieren kann, wie UV-Strahlen, Röntgenstrahlenund γ-Strahlen,oder das Behandeln eines nichtauxotrophen Stammes für L-Methioninmit einem chemischen Mutagenisierungsmittel, wie N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidin (NTG),und das nachfolgende Selektieren eines Stammes, der für L-Methioninauxotroph geworden ist. Unter diesen ist ein Verfahren unter Einsatzvon beispielsweise NTG bevorzugt. Obwohl es herkömmlicherweise bekannt ist,dass es extrem schwierig ist, einen Stamm von Methylophilus methylotrophuszu erhalten, der füreine spezifische Aminosäureauxotroph ist, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden,dass ein auxotropher Stamm fürL-Methionin selbst unter Einsatz eines chemischen Mutagenisierungsmittelserhalten werden kann.
    [0024] Wenn der metabolische Weg, der für die L-Methioninsynthesezuständigist, in einem Methanol verwertendem Bakterium mutmaßlich existiert,und ein Gen, das fürein Enzym in dem Biosyntheseweg kodiert, gefunden worden ist, kannaußerdemein Verfahren zur Ausschaltung eines Gens unter Einsatz homologerRekombination eingesetzt werden, um das Gen direkt auszuschaltenund somit einen auxotrophen Stamm für L-Methionin zu erhalten. Überdiesist es auch möglich,L-Methioninauxotrophie durch Einsatz einer genetischen Rekombinationstechnikzu verleihen, wobei eine Aktivitäteines Enzyms, das an der L-Methioninsynthese beteiligt ist, unterdrückt wird.Beispielsweise ist in Methylophilus methylotrophus das metA-Gen,das in SEQ ID NO: 15 gezeigt ist, ein Beispiel für ein Gen, das ein Enzym kodiert,das ausgeschaltet werden kann oder dessen enzymatische Aktivität unterdrückt werdenkann. Man geht davon aus, dass dieses Gen für Homoserin-o-acetyltransferasekodiert. Wie hierin eingehend beschrieben wird, benötigt Methylophilusmethylotrophus, das ein ausgeschaltetes metA-Gen enthält, L-Methioninund zeigt verbesserte L-Lysinproduktivität.
    [0025] Zudem umfassen Beispiele von Enzymen,deren funktionelle Beeinträchtigungenzu L-Methioninauxotrophie führen,die Enzyme des metabolischen Weges, der von Aspartatsemialdehydzu L-Methionin führt.Die "funktionelleBeeinträchtigungdes Enzyms" umfasstdie Verminderung der enzymatischen Aktivität in einem solchen Maß, dassdas Bakterium L-methioninauxotroph sein sollte, und zudem das imwesentlichen vollständigeVerschwinden der enzymatischen Aktivität. Wenn beispielsweise dieHomoserindehydrogenase beeinträchtigtist, ist der Phenotyp erwartungsgemäß Auxotrophie bezüglich L-Methioninund L-Threonin, und der Phenotyp der Beeinträchtigung von o-Succinylhomoserinsulfhydrylase(beispielsweise das metZ-Genprodukt) oder der Methioninsynthase(beispielsweise meE, metH etc.) ist ebenfalls erwartungsgemäß eine L-Methioninauxotrophie.Wenn jedoch unter diesen zwei oder mehr Arten von Enzymen, welchedieselbe enzymatische Reaktion katalysieren, in einem Methanol verwertendenBakterium vorkommen (wie es der Fall ist, wenn Enzyme, die dieselbeenzymatische Reaktion katalysieren, getrennt voneinander existieren,wie metE und metH), ist es bevorzugt, dass die Funktionen der beidenEnzyme gleichzeitig ausgeschaltet werden.
    [0026] Im folgenden wird das Verfahren zurAusschaltung der Aktivitätdes L-Methioninsyntheseenzyms unter Bezugnahme auf das metA-Genals Beispiel erklärt.Das metA-Gen kann auf einer genomischen DNA eines Mikroorganismus,der das Gen enthält,beispielsweise Methylophilus methylotrophus, durch Amplifizierendes Gens unter Einsatz der Polymerasekettenreaktion (im folgendenals "PCR" bezeichnet) erhaltenwerden. Die genomische DNA kann durch bekannte Verfahren hergestelltwerden. Beispiele von Primern, die für die PCR einsetzbar sind,umfassen Oligonukleotide mit den DNA-Sequenzen, die in den SEQ IDNOS: 7 und 10 gezeigt sind.
    [0027] Die Expression des metA-Gens kannbeispielsweise durch ein Verfahren zur Suppression der Expressioneines Gens auf Transkriptionsebene durch Einführen einer Substitution, Deletion,Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotidein eine Promotorsequenz des Gens zur Verminderung der Promotoraktivität durchgeführt werden(vgl. M. Rosenberg & D.Court, Ann. Rev. Genetics, 13, 319 (1979); P. Youderian, S. Bouvier & M. Susskind,Cell, 30, 843-853 (1982)). Außerdemkann die Expression des metA-Proteins aufTranslationsebene durch Substitution, Deletion, Insertion, Additionoder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in eine Region zwischender SD-Sequenz (Shine-Dalgarno-Sequenz) und dem Initiationskodondurchgeführtwerden (s. J. J. Dunn, E.Buzash-Pollert & F.W. Studier, Proc. Natl. Acad.Sci., U.S.A., 75, Seite 2743 (1978)).
    [0028] Außerdem kann für die Verminderungoder Eliminierung der spezifischen Aktivität des Homoserin-o-acetyltransferaseenzymsdas Modifizieren oder Zerstörender kodierenden Region des metA-Gens durch Substitution, Deletion,Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotidein eine Nukleotidsequenz der kodierenden Region durchgeführt werden.
    [0029] Ortsgerichtete Mutagenese (W. Kramer & H.J. Frits, Methodsin Enzymology, 154, 350 (1987)) und ein Verfahren zur Behandlungvon DNA, die ein Zielgen enthält,mit einem chemischen Mittel, wie Natriumhyposulfit oder Hydroxylamin(D. Shortle & D.Nathans, Proc., Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270 (1978)) können spezifischeingesetzt werden, um Substitution, Deletion, Insertion, Additionoder Inversion eines Nukleotids in ein Gen einzuführen.
    [0030] Die ortsgerichtete Mutagenese istein Verfahren unter Einsatz eines synthetischen Oligonukleotids, daswillkürlicheSubstitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion in spezifischeBasenpaare einführen kann.Um dieses Verfahren einzusetzen, wird zunächst ein Plasmid, welches eingewünschtesGen enthält, daskloniert wird und eine bekannte DNA-Nukleotidsequenz hat, zur Herstellungeines Einzelstranges denaturiert. Dann wird ein synthetisches Oligonukleotidsynthetisiert, das zu einer Region komplementär ist, in der die Mutationeingeführtwerden soll. Bei dieser Synthese wird die Sequenz des synthetischenOligonukleotids nicht als vollständigkomplementäreSequenz hergestellt, sondern so hergestellt, dass sie Substitutionen,Deletionen, Insertionen, Additionen oder Inversionen an willkürlichenNukleotiden enthält.Danach wird die einzelsträngigeDNA und das synthetische Oligonukleotid, welches Substitution, Deletion,Insertion, Addition oder Inversion eines willkürlichen Nukleotids enthält, zumDoppelstrang vereinigt und ein vollständiges doppelsträngiges Plasmidwird unter Einsatz eines Klenow-Fragmentsvon DNA-Polymerase I und T4-Ligase synthetisiert und in kompetenteZellen von Escherichia coli eingefügt. Einige der wie vorstehendbeschrieben erhaltenen Transformanten haben ein Plasmid, das dasgewünschteGen mit Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversioneines willkürlichenNukleotids enthält.
    [0031] Die rekombinante PCR-Methode (PCRTechnology, Stockton Press (1989)) kann als ähnliches Verfahren eingesetztwerden, das die Einführungund somit die Modifikation oder Zerstörung des Gens erlaubt.
    [0032] Außerdem ist das Verfahren unterEinsatz einer Behandlung mit einem chemischen Mittel ein Verfahrenzur statistischen Einführungeiner Mutation, einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion von Nukleotidenin ein DNA-Fragment, einschließlichein Zielgen, durch direktes Behandeln des DNA-Fragments mit Natriumhyposulfit,Hydroxylamin oder dergleichen.
    [0033] Die Expression des metA-Gens in einerZelle kann dadurch unterdrücktwerden, dass ein natives Gen auf einem Chromosom eines methanolverwertendenBakteriums durch das Gen, das wie vorstehend beschrieben erhaltenwurde und durch Einführungeiner Mutation modifiziert oder zerstört ist, ersetzt wird.
    [0034] Verfahren zur Gensubstitution umfassen,wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind, ein Verfahren unterEinsatz homologer Rekombination (Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); S. Matsuyama & S. Mizushima,J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). Die Fähigkeit, homologe Rekombinationzu bewirken, ist eine Eigenschaft, die allgemein in methanolverwertendenBakterien vorhanden ist. Wenn ein Plasmid oder dergleichen, daseine Sequenz mit einer Homologie zu einer Sequenz auf einem Chromosomhat, in eine Bakterienzelle eingeführt wird, kommt es mit einerbestimmten Häufigkeitzu einer Rekombination an einer homologen Stelle der Sequenz, unddas gesamte Plasmid wird in das Chromosom einverleibt. Danach wird,wenn die Rekombination bei einer homologen Sequenz auf dem Chromosombewirkt wird, das Plasmid wieder aus dem Chromosom entfernt. Zudiesem Zeitpunkt kann das eingeführtemutierte Gen auf dem Chromosom fixiert werden, und das native Genkann zusammen mit dem Plasmid entfernt werden, was von der Stelleabhängt,wo die Rekombination stattfindet. Durch Selektieren eines solchenStammes kann ein Stamm erhalten werden, worin ein Gen, das durchEinführeneiner Mutation, einschließlichSubstitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einesNukleotids modifiziert oder zerstört ist, ein natives Gen aufdem Chromosom ersetzt.
    [0035] Außerdem haben die Erfinder dervorliegenden Erfindung gefunden, dass in Methylophilus methylotrophusdie Einführungeines Gens, das zu einem gewünschtenGen auf einem Chromosom homolog ist, in der Form eines linearenDNA-Fragments eine homologe Rekombination zwischen dem gewünschtenGen auf dem Chromosom und dem homologen Gen des eingeführten linearenDNA-Fragments in der Zelle bewirkt, so dass eine Gensubstitutionerhalten werden konnte, wobei eine solche Technik auch angewendetwerden konnte. Ein Beispiel füreine Gensubstitution, die unter Einsatz dieser Technik durchgeführt wurde,wird in den Beispielen beschrieben.
    [0036] Um zu bestimmen, ob die Gensubstitutionwie beabsichtigt fortschreitet, kann beispielsweise ein Arzneimittelresistenzmarkergenfür dieResistenz gegen ein Antibiotikum in das einzuführende DNA-Fragment einverleibtwerden. Wenn ein Arzneimittelresistenzmarker auf diese Weise eingesetztwird, wird ein Gen, das Resistenz gegen ein Arzneimittel, wie Kanamycin,Gentamycin, Tetracyclin, Ampicillin oder Streptomycin auf ein methanolverwertendesBakterium überträgt, eingesetzt.
    [0037] Ein solches Markergen, das vorstehendbeschrieben wurde, kann fürdie Herstellung eines einzuführendenGens, dessen kodierende Region zerstört ist, durch Einsetzen indas Gen eingesetzt werden. Das zerstörte Gen, in das ein Markergeneingesetzt ist, kann durch eine Genrekombinationstechnik unter Einsatzeiner Plasmid-DNA hergestellt werden, wie in den nachstehenden Beispielengezeigt wird, oder es kann auch durch gleichzeitige Amplifikationdes einzuführendenGens und Einführendes Markergens durch Crossover-PCR hergestellt werden.
    [0038] In den Beispielen wurde ein Methylophilusmethylotrophus-Stamm, worin die Funktion des metA-Gens zerstört war,durch Ersetzen des metA-Gens aus einem Chromosom von Methylophilusmethylotrophus durch ein metA-Gen, worin ein Teil der kodierendenRegion entfernt war und ein Kanamycin-Resistenzgen anstelle des Teils derkodierenden Region unter Einsatz des vorstehend beschriebenen Verfahrensunter Verwendung homologer Rekombination eingeführt war, erhalten.
    [0039] Das erfindungsgemäße Bakterium kann durch Übertrageneiner L-Methioninauxiotrophie auf ein methanolverwertendes Bakteriummit der Fähigkeit,L-Lysin zu produzieren, wie vorstehend beschrieben erhalten werden.Das erfindungsgemäße Bakteriumkann auch durch Übertragender Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin auf ein methanolverwertendes Bakteriummit L-Methioninauxotrophie erhalten werden. Ein methanolverwertendesBakterium, beispielsweise ein Methylophilus methylotrophus-Stammmit der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin, kann durch Mutagenesebehandlung eines Stammes,der die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin nicht hat oder eine geringe Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat, erhalten werden, wobei diesem StammResistenz gegenübereinem L-Lysin-Analogon, wie S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (im folgendenals "AEC" bezeichnet), übertragenwird. Beispiele des Verfahrens fürdie Mutagenesebehandlung umfassen, wobei sie jedoch nicht daraufbeschränktsind, Verfahren zur physikalischen Behandlung des Stammes, beispielsweisemit UV-Strahlen, Röntgenstrahlenund γ-Strahlen,oder die Behandlung mit einem chemischen Mutagenisierungsmittel,wie NTG, wie vorstehend beschrieben, wobei ein L-methioninauxotropherStamm erhalten wird. Spezifische Beispiele von Methylophilusbakterienmit der Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin, die wie vorstehend beschrieben erhaltenwurden, umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind,Methylophilus methylotrophus AJ13608. Dieser Stamm wurde durch Übertragungder AEC-Resistenz auf Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm kultiviert.Methylophilus methylotrophus AJ13608 wurde beim National Instituteof Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Scienceand Technology (derzeit National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology, International Patent Organism Depositary,Tsukuba Central 6, -1, Higashi 1-come, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,305-8566, Japan) am 10. Juni 1999 hinterlegt und erhielt die HinterlegungsnummerFERM P-17416. Dann wurde die Hinterlegung in eine InternationaleHinterlegung am 31. März2000 unter der Maßgabedes Budapester Vertrages umgewandelt und erhielt die HinterlegungsnummerFERM BP-7112.
    [0040] Ein Methylophilusbakterium mit derFähigkeitzur Produktion von L-Lysin kann auch durch Einführen oder Verstärken derDNA, welche die genetische Information trägt, die an der Biosynthesevon L-Lysin beteiligt ist, mit einer genetischen Rekombinationstechnikgezüchtetwerden. Das Gen oder die Gene, die eingeführt werden sollen, kodierenfür einEnzym des Biosynthesewegs von L-Lysin, wie Dihydrodipicolinatsynthaseund Succinyldiaminopimelattransaminase. Im Fall eines Gens für ein Enzym,das einer Rückkoppelungshemmung durchL-Lysin unterliegt, wie Dihydrodipicolinatsynthase (DDPS), ist esbevorzugt, ein mutiertes Gen zu verwenden, das für das Enzym kodiert, das unempfindlichgegen die Rückkopplungshemmungist. Beispiele eines solchen mutierten Gens umfassen, wobei siejedoch nicht darauf beschränktsind, das dapA*24-Gen (kodiert fürDDPS, worin der Histidinrest in Position 118 durch einen Tyrosinrestersetzt ist) aus Escherichia coli, beschrieben in W095/16042, unddergleichen. Die anderen vorstehend erwähnten Gene sind auch in dieserInternationalen Patentveröffentlichungbeschrieben. In der Beschreibung dieser Internationalen Patentveröffentlichungsind ein Gen, das fürTetrahydrodipicolinatsuccinylase kodiert, und ein Gen, das für Succinyldiaminopimelattransaminasekodiert, vertauscht.
    [0041] Außerdem kann die Fähigkeitzur Produktion einer Aminosäureauch durch Verstärkender Aktivitäteines Proteins verbessert werden, das an der Sekretion der L-Aminosäure ausder Zelle heraus beteiligt ist.
    [0042] Beispielsweise ist als Protein, dasan der Sekretion von L-Lysin aus der Zelle heraus beteiligt ist,das LysE-Proteinbekannt, das von dem lysE-Gen kodiert wird (M. Vrljic, H.Sahm undL. Eggeling, Molecular Microbiology 22, Seiten 815-826 (1996); InternationalePatentveröffentlichungW097/23597). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten,dass ein Wildtyp-lysE-Gen, abgeleitet von Brevibacterium, in einemMethylophilusbakterium oder in einem Methylobacillusbakterium nichtfunktioniert, es konnte jedoch derart modifiziert werden, dass esin einem methylotrophen Bakterium funktionierte. Beispiele einessolchen modifizierten LysE-Proteins umfassen LysE24, welches inden vorliegenden Beispielen beschrieben wird.
    [0043] Das LysE-Protein, das durch das lysE-Genkodiert wird, hat sechs hydrophobe Helixregionen. Einige dieserhydrophoben Regionen sind vermutlich Transmembrandomänen. Eswird auch davon ausgegangen, dass eine Region zwischen der drittenund der vierten Region bezüglichdes N-Terminus hydrophil ist und eine Schleifenstruktur hat. Inder vorliegenden Erfindung wird die hydrophile Region als Schleifenregionbezeichnet. Die Nukleotidsequenz des Wildtyp-LysE- und die Aminosäuresequenzdes LysE-Proteins von Brevibacterium lactofermentum 2256 sind inden SEQ ID-Nummern17 bzw. 18 gezeigt. In dieser Aminosäuresequenz entsprechen diehydrophoben Helixregionen den Aminosäurenummern 5-20, 37-58, 67-93,146-168, 181-203 und 211-232. Die Schleifenregion entspricht denAminosäurenummern94-145.
    [0044] Die Erfinder der vorliegenden Erfindungfanden, dass das lysE-Gen in einem Methanol verwertenden Bakteriumletal wirkt, dass jedoch eine DNA, die für eine Variante des LysE-Proteinskodiert, welches die Schleifenregion nicht hat oder im wesentlichennur aus den hydrophoben Helices bestand, die Sekretion von Lysinund/oder L-Arginin aus der Zelle eines Methanol verwertenden Bakteriumsheraus förderte.Die erfindungsgemäße DNA kodiertfür einsolches mutiertes LysE-Protein, welches die vorstehend erwähnte Schleifenregion,die in einem Wildtyp-LysE-Protein enthalten ist, nicht aufweistoder welches im wesentlichen nur aus den hydrophoben Helices bestand.
    [0045] Das vorstehend erwähnte mutierteLysE ist nicht besonders eingeschränkt, solange es eine oder mehrere hydrophobeHelices hat und bei der Expression zu einer erhöhten Sekretion von L-Lysin,L-Arginin oder beiden führt,wenn es in ein Methanol verwertendes Bakterium eingeführt wird.Genauer gesagt ist eine DNA, die für ein mutiertes LysE kodiert,das alle hydrophoben Helices, bezogen auf den N-Terminus, nämlich die erstebis sechste Helix, enthält,mit umfasst. Im speziellen ist eine DNA mit umfasst, die ein Peptidkodiert, das die erste bis dritte hydrophobe Helix, bezogen aufden N-Terminus, enthältund fürein Peptid kodiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix,bezogen auf den N-Terminus, enthält.Das vorstehend erwähnteLysE24 ist ein Beispiel fürein mutiertes LysE, das fürein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, und einPeptid kodiert, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält. DaslysE24-Gen wird durch eine Mutation mit einem Stopkodon stromabwärts derkodierenden Region fürdie dritte hydrophobe Helix eingeführt. Die Erfinder der vorliegendenErfindung bestätigten,dass, wenn eine Region stromabwärtsdes Stopkodons deletiert ist, das mutierte lysE24-Gen die Anhäufung vonL-Lysin in dem Medium nicht bewirkt, wenn es in dem Methylophilusmethylotrophus AS1-Stamm exprimiert wird. Deshalb wird davon ausgegangen,dass ein Peptid, das die erste bis dritte hydrophobe Helix enthält, undein Peptid, das die vierte bis sechste hydrophobe Helix enthält, getrenntvoneinander translatiert werden und in einem Methanol verwertendenBakterium funktionieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Einführung deslysE24-Gens in ein Methanol verwertendes Bakterium zu einer Verbesserungder Produktion von L-Lysin und L-Arginin führt.
    [0046] Jeder Mikroorganismus kann eingesetztwerden, um eine DNA zu erzeugen, die für ein Protein kodiert, dasan der Sekretion von Lysin aus einer Zelle heraus beteiligt ist, d.h.das lysE-Gen oder ein homologes Gen, solange es eine Variante esGens hat, welche die L-Lysinsekretionsaktivität in einem Methanol verwertenden Bakteriumexprimieren kann. Genauer gesagt umfassen Beispiele solcher Mikroorganismen,wobei sie jedoch nicht auf coryneforme Bakterien beschränkt sind,Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium lactofermentum, Escherichiabakterien,wie Escherichia coli, Pseudomonasbakterien, wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacteriumbakterien,wie Mycobacterium tuberculosis und dergleichen.
    [0047] Beispiele des homologen Gens vonlysE umfassen eine DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einerSonde einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:17 oder einem Teil davonhybridisierbar ist und fürein Protein kodiert, welches die Funktion des LysE-Proteins in einemMethanol verwertenden Bakterium als Ergebnis der vorstehend erwähnten Aminosäuresubstitutionzeigt. Die vorstehend genannten "stringentenBedingungen" umfassenBedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildetwird und ein nichtspezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es istschwierig, diese Bedingung in Zahlenwerten auszudrücken. Beispielsweiseumfassen die stringenten Bedingungen jedoch eine Bedingung, unterder DNAs mit hoher Homologie, beispielsweise DNAs mit einer Homologievon 80% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr, stärker bevorzugt95% oder mehr, miteinander hybridisieren, während DNAs mit einer Homologie,die geringer ist als die vorstehend genannten Werte, nicht miteinanderhybridisieren. Alternativ dazu umfassen die stringenten Bedingungensolche, bei denen DNAs bei einer Salzkonzentration miteinander hybridisieren,welche der typischen Waschbedingung für die Southern-Hybridisierungentspricht, d.h. 1 × SSC,0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC,0,1% SDS, bei 60°C.
    [0048] Eine Teilsequenz der Nukleotidsequenzvon SEQ ID NO: 17 kann auch als Sonde eingesetzt werden. Eine solcheSonde kann durch PCR unter Einsatz von Oligonukleotiden, die aufder Grundlage der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 17 hergestelltwurden, als Primer und eines DNA-Fragments, welches die Nukleotidsequenzder SEQ ID NO: 17 enthält,als Matrize hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment mit einerLänge vonetwa 300 Basenpaaren als Sonde eingesetzt wird, können dieWaschbedingungen fürdie Hybridisierung beispielsweise 2 × SSC, 0,1% SDA bei 50°C sein.
    [0049] Um die Expression des Aminosäuresekretionsgensoder eines Gens des L-Lysinbiosynthesesystems in einem Methanolverwertenden Bakterium zu erhöhen,wird das Genfragment mit einem Vektor ligiert, der in einem Methanolverwertenden Bakterium funktionieren kann, vorzugsweise ein Vektorvom Mehrkopientyp, wobei eine rekombinante DNA hergestellt wird,die dann eingesetzt wird, um das Methanol verwertende Wirtsbakteriumzu transformieren. Alternativ dazu kann das Gen in ein Transposoneinverleibt und in das Chromosom eingeführt werden. Außerdem kannein Promotor, der eine effektive Transkription in einem Methanolverwertenden Bakterium induziert, stromaufwärts von diesem Gen ligiertwerden.
    [0050] Um ein Gen in ein Methylophilusbakteriumeinzuführenund dessen Expression zu verstärken,kann das Gen an einen Vektor ligiert werden, der in einer Zellevon Methylophilusbakterien autonom replizierbar ist, wobei einerekombinante DNA konstruiert wird, die dann eingesetzt wird, umein Methylophilusbakterium durch Elektroporation oder dergleichenzu transformieren. Zusätzlichist es auch möglich,ein Zielgen in ein Wirtschromosom dadurch einzuverleiben, dass Transduktion,ein Transposon (D.E. Berg und C.M. Berg, Bio/Technol., 1, Seite417, 1983), ein Mu-Phage (offengelegtes Japanisches Patent (Kokai)Nr.2-109985)oder homologe Kombination (Experiments in Molecular Genetics, ColdSpring Harbor Lab. (1972)) eingesetzt wird.
    [0051] Die Vektoren, die in Methylophilusbakterienfunktionieren, umfassen, wobei sie jedoch nicht darauf beschränkt sind,ein Plasmid, das in Methylophilusbakterien autonom replizierbarist. Genauer gesagt umfassen Beispiele RSF1010, welcher ein Vektormit breitem Wirtsbereich ist, und Derivate davon, beispielsweise pAYC32(A.Y. Chistorerdov, Y.D. Tsygankov, Plasmid, 16, Seiten 161-167(1986)), pMFY42 (Gene, 44, Seite 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature,287, S. 396 (1980)) und dergleichen.
    [0052] Der Vektor, der in Methylobacillusbakterienfunktioniert, ist, wobei er jedoch nicht darauf beschränkt ist,ein Plasmid, das in Methylobacillusbakterien autonom replizierenkann. Genauer gesagt umfassen Beispiele RSF1010, der ein Vektormit breitem Wirtsbereich ist, und Derivate davon, beispielsweisepMFY42 (Gene, 44, S. 53 (1990)) und dergleichen.
    [0053] Jede Methode kann eingesetzt werden,um ein rekombinantes DNA-Molekülin ein Methylophilusbakterium einzuführen, solange es ausreichendeTransformationseffizienz bereitstellt. Beispielsweise kann Elektroporationverwendet werden (Canadian Journal of Microbiology, 43, S. 197 (1997)).
    [0054] Produktion von L-Lysin unter Einsatzeines Methanol verwertenden Bakteriums, dem L-Methioninauxotrophieverliehen wurde
    [0055] Die Kultivierung eines Methanol verwertendenBakteriums, dem L-Methioninauxotrophie durch Zerstörung desmetA-Gens oder durch Mutagenesebehandlung verliehen wurde und dasdie Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin, erhalten wie vorstehend beschrieben,in einem Medium hat, dem eine geeignete Menge von L-Methionin zugesetztist, führtzur Produktion einer merklichen Menge von L-Lysin und zur Anhäufung des produziertenL-Lysins in dem Medium. Somit ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Methanolverwertenden Bakteriums, dem L-Methioninauxotrophie verliehen wurde,und das die Fähigkeitzur Produktion von L-Lysin hat, zur Erhöhung der angehäuften Mengevon L-Lysin wirksam.
    [0056] Das für die Produktion von L-Lysineingesetzte Medium ist ein typisches Medium, das eine Kohlenstoffquelle,Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Spurennährstoffe,soweit erforderlich, enthält.Die Hauptkohlenstoffquelle ist Methanol. Es können jedoch Zucker, wie Glucose,Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysate, Alkohole wieGlycerin und Sorbitol und organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure undBenztraubensäure,zusammen eingesetzt werden. Der Ausdruck "Methanol wird als Hauptkohlenstoffquelleeingesetzt" bedeutet,dass der Methanolgehalt in der Gesamtkohlenstoffquelle 50 % (Gew./Gew.)oder mehr, vorzugsweise 80% (Gew./Gew.) oder mehr beträgt. WennMethanol als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt wird, ist dessenKonzentration üblicherweisezwischen 0,001 bis 4% (Gew./Vol.), vorzugsweise zwischen 0,1% bis2% (Gew./Vol.). Außerdemist, wenn Glucose u.s.w. zugegeben wird, dessen Konzentration üblicherweisezwischen 0,1% und 3% (Gew./Gew.), vorzugsweise zwischen 0,1% bis1% (Gew./Vol.).
    [0057] Außerdem muss das Medium einegeeignete Menge L-Methionin enthalten. Obwohl der Gehalt vorzugsweisein Abhängigkeitvon den Kulturbedingungen eingestellt wird, ist er üblicherweiseinnerhalb eines solchen Bereichs, dass der L-Methioningehalt nichtausreichend ist, so dass das Wachstum des Bakteriums limitiert seinsollte, was die effizienteste Produktion von L-Lysin durch das Bakteriumerlaubt. Beispielsweise ist der L-Methioningehalt in dem Mediumvorzugsweise zwischen 0,01 bis 1 g/l.
    [0058] Als Stickstoffquelle können anorganischeAmmoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat,organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wässerigesAmmoniak u.s.w. eingesetzt werden.
    [0059] Als anorganische Ionen (oder derenQuellen) kann eine kleine Menge Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat,Eisenionen, Manganionen u.s.w. zu dem Medium gegeben werden. Alsorganische Spurennährstoffe kannVitamin B1, Hefeextrakt u.s.w. in geeigneterMenge zu dem Medium gegeben werden.
    [0060] Die Kultivierung wird vorzugsweisezwischen etwa 16 und 72 Stunden unter aeroben Bedingungen durchgeführt. DieKultivierungstemperatur wird auf zwischen 25 und 45°C eingestellt,und der pH-Wert wird währendder Kultivierung zwischen 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oderorganische saure oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas und dergleichenkönneneingesetzt werden, um den pH-Wert einzustellen.
    [0061] Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierungkann L-Lysin aus der Fermentationsbrühe beispielsweise durch übliche Verfahrenunter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes, Ausfällung und anderen bekanntenVerfahren in Kombination gewonnen werden.
    [0062] Im folgenden wird die vorliegendeErfindung unter Bezugnahme auf die folgenden nichtlimitierenden Beispieleeingehend erklärt.
    [0063] Ein Wildtypstamm von Methylophilusmethylotrophus, AS1-Stamm (NCIMB 10515), wurde mit N-Methyl-N'-nitronitrosoguanidin(NTG) behandelt, um einen L-Methioninauxotrophen Stamm, wie nachstehendbeschrieben, zu isolieren. Zuerst wurde ein Tag vor der Behandlungmit NTG der Wildtypstamm AS1 in 50 ml des SEII-Mediums geimpft (Zusammensetzung:1,9 g/l K2HPO4,5,0 g/l (NH4)2SO4, 1,56 g/l NaHP2O4·2H2O, 0,2 g/l MgSO4·7H2O, 0,72 mg/l CaCl2·6H2O, 5 μg/lCuSO4·5H2O, 25 μg/lMnSO4·5H2O, 23 μg/lZnSO4·7H2O, 9,7 mg/l FeCl3·6H2O, 1% (Vol./Vol.) Methanol) und über Nachtbei 37 °Cunter Schüttelnkultiviert. Eine NTG-Lösung wurdein einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt (hergestellt durchAuflösenvon NTG in Dimethylsulfoxid (DMSO)).
    [0064] Am nächsten Tag wurden die kultiviertenZellen durch Zentrifugation bei 4°Cgewonnen, und 50 ml eisgekühlter50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) wurden zu den Zellen gegeben,um diese zu suspendieren. Dann wurde die Suspension erneut zentrifugiert,und der Überstandwurde entfernt, um die Zellen einmal zu waschen. Die Zellen wurdenin 2 ml desselben Puffers suspendiert und in zwei Eppendorfröhrchen ingleiche Volumen aufgeteilt. Eines davon wurde für die NTG-Behandlung eingesetzt,und das andere wurde als Kontrolle verwendet, das nicht mit NTGbehandelt wurde. 10 μlder NTG-Lösungoder einer DMSO-Lösung, welche NTGnicht enthielt, wurden in jedes Röhrchen gegeben. Auf dieserStufe betrug die Endkonzentration von NTG in der Probe, welche derNTG-Behandlung unterworfen wurde, 0,1 mg/ml. Die Proben wurden 5Minuten bei 37°Cbehandelt und 2 Minuten auf Eis stehen gelassen, und dann wurdejede Probe 2 Minuten bei 15.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert,um die Zellen zu gewinnen.
    [0065] Die gewonnenen Zellen aus jeder Probewurden zweimal mit eisgekühltemSEII-Medium gewaschen, dann in 3 ml des SEII+MT-Mediums (Zusammensetzung:SEII-Medium, welches L-Methionin(1 g/l) und L-Threonin (10 g/l) enthielt) suspendiert und über Nachtbei 37°Ckultiviert. Auf dieser Stufe wurde ein Teil jeder Probe extrahiertund auf ein SEII-Agarmedium geimpft (Zusammensetzung: SEII-Medium,das 1,5 % (Gew./Vol.) Agar enthielt) und die Anzahl der erschienenenKolonien (Anzahl lebensfähigerBakterien) wurde verwendet, um die Sterblichkeitsrate aufgrund derNTG-Behandlung zu berechnen. Die Sterblichkeitsrate wurde ausgedrückt als[Anzahl lebensfähigerZellen in der Probe, die einer NTG-Behandlung unterworfen wurde/AnzahllebensfähigerZellen in der Probe, die nur mit DMSO-Lösung behandelt wurde].
    [0066] Am Tag nach der NTG-Behandlung wurdeein Teil der verstehend erwähntenKulturbrühein das SEII+MT-Medium bei 37°Ceingeeimpft, um die Zellen zu züchten.Nachdem der Absorptionswert der Kulturbrühe bei einer Wellenlänge von660 nm (OD 660 nm) etwa 0,5 erreicht hatte, wurde das geliche Volumeneiner 20%-igen DMSO-Lösung(Endkonzentration: 10%) fürdie Konservierung der Zellen zugegeben, und die Kulturbrühe wurdeausreichend gerührtund dann bei -80°Cgelagert. Außerdemwurde ein Teil der Kulturbrühe aufdas SEII-MT-Agarmedium und das SE-II-Agarmedium geimpft, das 50 μg/ml desAntibiotikums Streptomycin (Sm) enthielt, und die auftretende HäufigkeitSm-resistenter Stämme,d. h. die Mutationsrate, wurde gemessen. Es zeigte sich, dass dieMutationsrate etwa 4 × 10–6 war.
    [0067] Die Stammlösung des Bakteriums, das mitNTG behandelt wurde, wurde bei Raumtemperatur aufgetaut, und 1 bis1/10–7- fache Reihenverdünnungendavon wurden hergestellt und auf das SEII-MT-Agarmedium geimpft.Die Zellen wurden zwei Tage bei 37°C kultiviert, und der Verdünnungsgrad,der die Bildung von 10 bis 200 Kolonien pro Agarplatte bereitstellte,wurde festgestellt. Dann wurde die Ausgangslösung des Bakteriums erneutauf diese Konzentration verdünntund auf das SEII-MT-Agarmedium geimpft. Die Zellen wurden drei Tagebei 37°Ckultiviert, und dann wurden die auftretenden Kolonien auf eine SEII-Agarmediumplatteund eine SEII+MT-Agarmediumplatteals Replika aufgetragen, um die Kolonien zu isolieren, die auf demSEII-MT-Agarmedium wachsen können,jedoch auf dem SEII-Agarmedium nicht wachsen können. Dann wurden die selektiertenKolonien nacheinander auf das SEII-Agarmedium, SEII+MT-Agarmedium(Zusammensetzung: Agarmedium, das L-Methionin (1 g/l) in dem SEII-Medium enthielt),SEII+T-Agarmedium (Zusammensetzung: Agarmedium, das L-Threonin (10g/l) in dem SEII-Medium enthielt) und das SEII+MT-Agarmedium geimpft,und es wurde untersucht, ob die Aminosäureauxotrophie dieser Kloneeine Auxotrophie fürL-Methionin, L-Threonin oder beide war.
    [0068] Es zeigte sich, dass zwei der L-Methionin-auxotrophenStämmeund einer der L-Threonin-auxotrophen Stämme erhalten werden konnten.Diese wurden als MR102-Stamm, MR103-Stamm bzw. TR115-Stamm bezeichnet.Es konnte in diesem Experiment kein Stamm erhalten werden, der diesebeiden Aminosäurenfür seinWachstum benötigt.
    [0069] Um das lysE-Gen, welches für ein Proteinkodiert, das eine Aktivitätzur Exkretion von Lysin in Corynebakterium glutamicum hat, in einMethylophilusbakterium einzuführen,wurde das bekannte Plasmid pRS (Internationale Patentveröffentlichungin Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682) eingesetzt, um ein Plasmid pRSlysE für die Expressionvon lysE zu konstruieren. pRS ist ein Plasmid mit dem Vektorsegmentdes pVIC40-Plasmids (Internationale Patentveröffentlichung W090/04636, InternationalePatentveröffentlichungin Japanisch Nr. 3-501682), das aus pVIC40 durch Deletion einerDNA-Region erhalten wurde, welche das Threoninoperon enthielt undauf dem Plasmid vorhanden war. Das Plasmid pVIC40 ist von einemVektorplasmid pAYC32 mit breitem Wirtsbereich (Chistorerdov, A.Y.,Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167) abgeleitet, welchesein Derivat von RSF1010 ist.
    [0070] Zuerst wurde ein Plasmid pRStac mitdem tac-Promotor aus pRS konstruiert. Das pRStac-Plasmid wurde wiefolgt konstruiert. Der pRS-Vektor wurde mit den RestriktionsenzymenEcoR1 und PstI verdaut und zu einer Phenol/Chloroformlösung gegebenund zum Abbrechen der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugationdes Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen und DNAswurden durch Ethanolausfällung gewonnenund auf einem 0,8%-Agarosegel abgetrennt. Ein DNA-Fragment aus 8Kilobasenpaaren ("kbp") wurde unter Verwendungvon EASY TRAP Ver.2 (DNA-Gewinnungskit, Takara Shuzo) gewonnen.Auf der anderen Seite wurde die Tac-Promotorregion durch PCR unterVerwendung des pKK223-3-Plasmids (Expressionsvektor, Pharmacia)als Matrize und der Primer, die in SEQ ID NOS: 1 und 2 gezeigt sind,amplifiziert (ein Zyklus bestand aus der Denaturierung bei 94°C während 20Sekunden, Annealing bei 55°Cwährend30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktionbei 72°Cwährend60 Sekunden, und dieser Zyklus wurde dreißigmal wiederholt). Pyrobest-DNA-Polymerase(Takara Shuzo) wurde fürdie PCR eingesetzt. Das DNA-Fragment, das den amplifizierten tac-Promotorenthielt, wurde unter Verwendung von PCR-Prep (Promega) gereinigtund dann an den Restriktionsenzymstellen verdaut, die vorher inden Primern konstruiert worden waren, d. h. an den EcoRI- und denEcoT22I-Stellen. Dann wurde das Reaktionsgemisch zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegebenund zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugationdes Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und dieDNAs wurden durch Ethanolausfällunggewonnen und auf einem 0,8%-Agarosegel getrennt. Ein DNA-Fragmentvon etwa 0,15 kbp wurde unter Einsatz von EASY TRAP Ver.2 gewonnen.
    [0071] Das Verdauungsprodukt des pRS-Vektorsund das tac-Promotorregionfragment,das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurden unter Einsatzdes DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) ligiert. Die Ligierungsreaktionslösung wurdeeingesetzt, um Escherichia coli zu transformieren (E. coli JM109-kompetente Zellen,Takara Shuzo). Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, das 20 mg/lStreptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweils in LB-Flüssigmedium,das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert.Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahrenextrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauungmit Restriktionsenzymen bestätigt,wobei pRS-tac erhalten wurde. Ein Plasmid, worin die Transkriptionsrichtungendes Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promotors identischwaren, wurde als pRStac selektiert.
    [0072] Das wie vorstehend erhaltene pRStacwurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolobs)verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und zur Beendigungder Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemischeswurde die obere Schicht gewonnen und die DNAs wurden durch Ethanolausfällung gewonnenund auf einem 0,8%-Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment mit etwa9,0 kbp erhalten wurde.
    [0073] Das lysE-Genfragment wurde auch durchPCR unter Einsatz von Chromosomen, die aus dem Brevibacterium lactofermentum2256-Stamm (Corynebacterium glutamicum ATCC13869) extrahiert wurden,als Matrize und den Primern, die in den SEQ ID Nummern 5 und 6 gezeigtsind, amplifiziert (Denaturierung bei 95°C während 20 Sekunden, Annealingbei 55°Cwährend30 Sekunden und Verlängerungsreaktionbei 72°C während 90Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCReingesetzt. Um die Expression des lysE-Gens in einem Methylophilusbakteriumzu ermöglichen,wurden die Primer so konstruiert, dass Nukleotide mit 9-15 by ausdem Translationsinitiationskodon des lysE-Gens durch eine Sequenzersetzt sein sollten, die bekanntlich in einem Methylophilusbakteriumfunktioniert (Wyborn, N.R., Mills, J., Williamis, S.G. und Jones,C.W., Eur.J.Biochem., 240, 314-322 (1996)). Das erhaltene Fragmentwurde unter Einsatz von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mitSse8387I und SapI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroformlösung gegebenund zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugationdes Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAswurde durch Ethanolausfällung gewonnenund mit einem 0,8%-Agarosegel getrennt.
    [0074] Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektorsund das lysE-Genregionfragment,das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurden unter Einsatzdes DNA-Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligierungsreaktionslösung wurdeeingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM109-kompetente Zellen,Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium,das 20mg/L Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden in LB-Flüssigmedium,das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert.Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert,und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymenund durch Bestimmen der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pRSlysE erhaltenwurde. In pRSlysE ist das lysE-Gen so positioniert, dass seine Transkriptionsrichtung dieselbeist wie die des tac-Promotors.
    [0075] pRSlysE, das wie vorstehend erhaltenwurde, wurde in einen Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515)durch Elektroporation eingeführt(Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Zusätzlich wurdeauch pRS in den AS1-Stamm als Kontrolle auf dieselbe Weise wie pRSlysEeingefügt.Im Ergebnis wurden mehrere Tausend Kolonien pro 1 μg DNA mitpRS als Kontrolle erhalten, während nurmehrere Kolonien mit pRSlysE erhalten wurden.
    [0076] Nach der Extraktion der Plasmideaus den Transformantenstämmen,die pRSlysE mutmaßlichenthielten, und der Untersuchung der Nukleotidsequenzen wurde gefunden,dass eine spontane Mutation in einer Region, die für lysE kodiert,in allen untersuchten Plasmiden eingeführt war, und in einigen Fällen wurdeeine Unsinnmutation mit einem Kodon, bei dem ein Kodon für eine Aminosäure durchein Stopkodon, das die Translation beendet, ersetzt war, eingeführt. Außerdem wurdein anderen Plasmiden die Deletion des lysE-Gens beobachtet. Mangeht davon aus, dass in beiden Fällendie Funktion von LysE, das auf solchen Plasmiden enthalten war,verloren gegangen war.
    [0077] Wie vorstehend beschrieben war dieEinführungshäufigkeitvon pRSlysE, welches das lysE-Gen in voller Länge enthält, in Methylophilus methylotrophusextrem gering, und nur Plasmide mit einem lysE-Mutantengen, daseine Mutation enthielt, die die Funktion eliminierte, konnten eingeführt werden.Angesichts dieser Tatsachen wurde vermutet, dass die Einführung deslysE-Gens in Methylophilus methylotrophus einen letalen Effekt hätte. Diesdeutet darauf hin, dass das lysE-Gen für die Sekretion von L-Lysinin heterogenen Bakterien nicht universell funktionieren kann.
    [0078] Der Methylophilus methylotrophusAS1-Stamm, der pRSlysE, das eine Mutation aufwies, enthielt, wurdeauf eine SEII-Platte, die 20 mg/l Streptomycin enthielt, aufgetragenund überNacht bei 37°Ckultiviert. Dann wurden die Zellen von etwa 0,3 m2 derMediumoberflächeabgenommen, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml), das 20 mg/l Streptomycinenthielt, geimpft, und 34 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach dem vollständigen Ablaufder Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt,und die L-Lysinkonzentration in dem Kulturüber stand wurde unter Einsatzeines Aminosäureanalysiergerätes bestimmt(Nikon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie).Es zeigte sich, dass im wesentlichen kein Stamm erhalten wurde,worin die Sekretion von L-Lysin verstärkt war, obwohl das mutiertelysE-Gen eingeführtwurden war.
    [0079] Wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben,wurde angenommen, dass das bekannte lysE-Gen in Methylophilusbakterienletal ist, und im Ergebnis wurden viele Mutantengene, deren Funktionverloren gegangen war, nachfolgend erhalten.
    [0080] Währendder Analyse von pRSlysE, das eine Mutation enthielt, wurde ein mutierteslysE-Gen, das in Methylophilusbakterien funktionierte, jedoch nichtletal war, erhalten.
    [0081] Dieses mutierte lysE-Gen wurde alslysE24-Gen bezeichnet. Bei der Analyse der Nukleotidsequenz deslysE24-Gens wurde gefunden, dass die Mutation nicht zu einer Aminosäuresubstitutionführte,sondern zu einer Unsinnmutation, welche ein Stopkodon um die Mitteder Translationsregion von LysE einführte. In lysE24 wurde T (Thymin)nach G (Guanin) bei Position 355 des Wildtyp-lysE-Gens, gezeigt inSEQ ID NO: 17, eingeführt.Das Plasmid mit LysE24 wurde als pRSlysE24 bezeichnet.
    [0082] Der E. coli JM109-Stamm, der mitpRSlysE24 transformiert war, wurde als AJ13830 bezeichnet, und dieserStamm wurde am 4. Juni 2001 bei der unabhängigen VerwaltungsgesellschaftNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology,International Patent Organism Depository hinterlegt und erhieltdie Hinterlegungsnummer FERM P-18369. Dann wurde die Hinterlegungam 13. Mai 2002 in eine internationale Hinterlegung unter den Bestimmungendes Budapester Vertrages umgewandelt und erhielt die HinterlegungsnummerFERM BP-8040.
    [0083] Es wurde ein Plasmid mit einem Gen(dapA*), welches fürDihydrodipicolinatsynthase kodiert, welche nicht der Rückkopplungshemmungdurch L-Lysin unterliegt, als Gen für ein Enzym des L-Lysinbiosynthesesystemshergestellt.
    [0084] pRStac, hergestellt in Beispiel 2,wurde mit Sse83871 und XBaI verdaut, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegebenund zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugationdes Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und dieDNA wurde durch Ethanolausfällunggewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragmentmit etwa 9 kbp erhalten wurde.
    [0085] Das bekannte Plasmid RSFD80 (WO 90/16042),welches das dapA*-Genfragment enthielt, wurde als Matrize zur Amplifizierungvon dapA* durch PCR unter Einsatz der in SEQ ID NOS: 3 und 4 eingesetzt(Denaturierung bei 94°Cwährend20 Sekunden, Annealing bei 55°Cwährend30 Sekunden und Verlängerungsreaktionbei 72°Cwährend60 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für de PCReingesetzt. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Einsatz vonPCR preg (Promega) gereinigt und dann mit Restriktionsenzymen Sse83871und XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegebenund zur Beendigung der Reaktion gemischt. Nach der Zentrifugationdes Reaktionsgemisches wurde die obere Schicht gewonnen, und DNAwurde durch Ethanolausfällunggewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragmentvon etwa 0,1 kbp erhalten wurde.
    [0086] Das Verdauungsprodukt des pRStac-Vektorsund das dapA*-Genregionfragment, hergestellt wie vorstehend beschrieben,wurden unter Einsatz eines DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo)ligiert. Diese Ligierungsreaktionslösung wurde eingesetzt, um Escherichiacoli (E. coli JM109-kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren.Die Zellen wurden auf LB Agarmedium, das 20 mg/Streptomycin enthielt,plattiert und über Nachtbei 37°Cinkubiert. Die auf dem Agarmedium auftretenden Kolonien wurden jeweilsin LB-Flüssigmedium,das 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert.Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturbrühe durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert,und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymenenund Bestimmmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei ein pRSdapA-Plasmiderhalten wurde. In dem pRS-dapA-Plasmid war das dapA*-Gen so positioniert,dass eine Transkriptionsrichtung dieselbe wie die des tac-Promotorsist.
    [0087] Der E. coli-Stamm JM109, der mitdem pRS-dapA-Plasmid transformiert war, wurde als AJ13831 bezeichnet,und dieser Stamm wurde 4. Juni 2001 bei der unabhängigen VerwaltungsgesellschaftNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology,International Patent Organism Depository am hinterlegt und erhieltdie Hinterlegungsnummer FERM P-18370. Dann wurde die Hinterlegungam 13. Mai 2002 in eine Internationale Hinterlegung unter der Maßgabe desBudapester Vertrages umgewandelt und erhielt die HinterlegungsnummerFERM BP-8041.
    [0088] Ein Plasmid, das aus dem PlasmidpRSlysE24 mit eingefügtemdapA*-Gen bestand, wurde konstruiert, um die Wirkung der Kombinationvon lysE24 und dapA* zu untersuchen.
    [0089] pRSlysE24, hergestellt in Beispiel2, wurde mit dem Restriktionsenzym SapI verdaut und unter Verwendungdes DNA Blunting Kits (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen.DAs Plasmid pRSlysE24 mit dapA* wurde mit Restriktionsenzymen EcoRIund SapI verdaut, und ein Fragment mit etwa 1 kbp, welches den tac-Promotorund die dapA*-Region enthielt, wurde auf einem 0,8%-Agarosegel abgetrennt.Dieses Fragment wurde unter Einsatz von EASY TRAP Ver. 2 (TakaraShuzo) gewonnen. Dieses Fragment wurde wie vorstehend beschriebenmit glatten Enden versehen und an das vorstehend beschriebene Verdauungsproduktvon pRSlysE24 unter Verwendung von DNA Ligation Kit Ver. 2 (TakaraShuzo) ligiert.
    [0090] Die vorstehend erwähnte Ligierungsreaktionslösung wurdeeingesetzt, um Escherichia coli (E. coli JM 109-kompetente Zellen, Takara Shuzo) zutransformieren. Die Zellen wurden auf LB-Agarmedium, das 20 mg/l Streptomycinenthielt, plattiert. Nachdem die Agarplatte über Nacht bei 37°C inkubiertworden war, traten auf dem Agarmedium viele Kolonien auf. Unterdiesen wurden 8 Kolonien jeweils in ein LB-Flüssigmedium, das 20 mg/l Streptomycinenthielt, geimpft und 8 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Plasmid-DNAwurde aus jeder Kulturbrühedurch das Alkali-SDS-Verfahrenextrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauungmit Restriktionsenzymen und Bestim mung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobeidie Plasmide pSEA10 und pSEA12 erhalten wurden. In diesen Plasmidenwaren das lysE24-Gen und das dapA*-Gen so angeordnet, dass ihreTranskriptionsrichtungen im erstgenannten umgekehrt zueinander lagen,und sie waren so angeordnet, dass ihre Transkriptionsrichtungenim letztgenannten identisch waren.
    [0091] Das Plasmid, welches die Gene trug,wurde in Methylophilus methyotrophus Wildtyp-Stamm AS1 und in zweider L-methioninauxotrophen StämmeMR102 und MR103 durch das Konjugationstransferverfahren eingeführt. AmTag vor dem Konjugationsverfahren wurden der Stamm AS1, der StammMR102 und der Stamm MR103 als Empfängerstämme jeweils in 15 ml des SEII+M-Mediumskultiviert (Zusammensetzung: SEII-Medium, enthaltend 0,5 g/l L-Methionin).Der E. coli-Stamm HB101, der pRK2013 enthielt, wurde als Mobilisiererauf 10 ml des LB (Km)-Mediums geimpft (LB-Medium, enthaltend 25 μg pro mlKanamycin), der E.coli-Stamm JM109, der pSEA12 trug, wurde in 3ml LB(Sm)-Medium (LB-Medium, enthaltend 20 μg/ml Streptomycin) als Donorgeimpft und diese Stämmewurden kultiviert.
    [0092] Am nächsten Tag wurde jede Kulturbrühe zentrifugiert,um die Zellen zu gewinnen und die Zellen wurden einmal mit dem LB-Mediumfür denE.coli-Stamm HB101, der pRK2013 enthielt, und dem E.coli-Stamm JM109,der pSEA12 enthielt, gewaschen. Außerdem wurden für die dreiStämmeder vorstehend genannten Methanol verwertenden Bakterien die Zellenauch gewonnen und dann mit dem SEII-Medium ge waschen. Dann wurdendie E.coli-Zellen jeder Art in dem LB-Medium suspendiert, und dieZellen der Methanol verwertenden Bakterien wurden in dem SEII-Mediumsuspendiert. Dann wurden geeignete Volumen der Suspensionen aufdem LB-Agarmedium unter Einsatz einer Impföse gemischt und 4 Stunden bei37°C inkubiert,um den Konjugationstransfer von pSEA12 in jeden der Stämme AS1,MR102 und MR103 zu bewirken. Dann wurden die Zellen jedes Stammesvon dem Agarmedium abgeschabt und auf das SEII+M (Sm)-Agarmedium(Zusammensetzung: SEII+M-Agarmedium, enthaltend Sm (50 μg/ml)) verbreitetund bei 37°Cfür dieSelektion von Transformanten kultiviert. Jede einzelne Kolonie,die auf dem Medium erschien, wurde außerdem zweimal auf einem frischenSEII+M (Sm)-Agarmedium ausplattiert, um den Stamm MR102(pSEA12)und den Stamm MR103(pSEA12) als Zielstämme und den Stamm AS1(pSEA12)als Kontrollstamm zu isolieren.
    [0093] Jeder der drei vorstehend genanntenStämmewurde auf die SEII+M(Sm)-Agarplatte aufgetragen und über Nachtbei 37°Ckultiviert. Dann wurden die auf der Mediumoberfläche gewachsenen Zellen aufeiner Flächevon etwa 3 cm2 abgeschabt, in das SEII-Produktionsmedium(20 ml), welches L-Methionin in verschiedenen Konzentrationen enthielt,geimpft und 48 Stunden bei 37° unterSchüttelnkultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durchZentrifugation entfernt, und die L-Lysinkonzentration in dem Kulturüberstandwurde unter Einsatz eines Aminosäureanalysiergeräts bestimmt(Nikon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie).Im Ergebnis wurde eine L-Lysinanhäufung in dem Medium mit demStamm AS1(pSEA12) von 0,96 g/l als Höchstwert erhalten. Die Stämme MR102und MR103, in denen pSEA12 eingeführt worden war, zeigten L-Lysinanhäufungenin dem Medium von 1,675 g/l bzw. 1,57 g/l, wenn 0,075 g/l L-Methioninzu dem Produktions medium gegeben wurde, und somit war die L-Lysinanhäufung indem Medium erheblich verbessert.
    [0094] Aus dem Methylophilus methylotrophus-StammAS1 wurde ein Fragment fürdie Zerstörungdes Gens zur Herstellung eines L-methioninauxotrophen Stammes durchGenzerstörunghergestellt. Als zu zerstörendes Genwurde eine Genregion ausgewählt,die hohe Homologie zu dem metA-Gen des Mycobacterium tuberculosis-StammesH37Rv hatte (GenBank Hinterlegungsnummer CAA 17113), wobei dieseGenregion vermutlich Homoserin-o-acetyltransferase kodiert. DieseRegion kann durch PCR unter Einsatz der in SEQ ID NOS: 7 und 10gezeigten DNA-Primer amplifiziert werden (Reaktionsbedingungen:Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus der Reaktionsstufender Denaturierung: 94°Cwährend30 Sekunden, Annealing: 60°Cwährend30 Sekunden und DNA-Strangverlängerungsreaktion:72°C während 4Minuten; dieser Zyklus wurde 25-mal wiederholt). Die DNA-Sequenzder Region und die Aminosäuresequenz,die davon kodiert wird, sind in den SEQ ID NO: 15 und 16 gezeigt,und das Gen wurde als metA-Gen bezeichnet.
    [0095] Um eine chromosomale DNA aus demWildtypstamm ASl zu erhalten, wurde der Stamm AS1 in 50 ml SEII-Medium(Zusammensetzung 5 g/l (NH4)2SO4, 1,9 g/l K2HPO4, 1,56 g/l NaH2PO4·2H2O, 200 mg/l MgSO4·7H2O, 72 mg/l CaCl2·6H2O, 5 μg/lCuSO4·5H20, 25 μg/lMnSO4·5H2O, 23 μg/lZnSO4·7H2O, 9,7 mg/l FeCl3·6H2O, 0,5% (Vol./Vol.) Methanol) geimpft und über Nachtbei 37°Cunter Schüttelnkultiviert. Dann wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellenzu gewinnen, und eine chromosomale DNA wurde unter Verwendung eineskäuflicherwerbbaren Kits hergestellt (Genomic DNA Purification Kit (hergestelltvon Edge Biosystems).
    [0096] Die erhaltene chromosomale DNA wurdeals Matrize mit den in den SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigten DNA-Primernfür diePCR eingesetzt (Reaktionsbedingungen: Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt;ein Zyklus bestand aus den Reaktionsstufen der Denaturierung: 94°C während 30Sekunden, Annealing: 60°Cwährend 30Sekunden, und DNA-Strangverlängerungsreaktion:72°C während 2Minuten; dieser Zyklus wurde 25-mal wiederholt), wodurch ein Fragmentvon etwa 1,3 kb erhalten wurde. Die PCR wurde auch unter Einsatzder Primer, gezeigt in SEQ ID NO: 9 und 10, unter denselben Bedingungendurchgeführt,wobei ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,0 kb erhaltenwurde.
    [0097] Die PCR wurde auch unter Verwendungdes Plasmids pKD4 (GenBank Hinterlegungsnummer AY048743, Datsenko,K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12), 6640-6645, 2000)als Matrize und den Primern, gezeigt in SEQ ID NO: 11 und 12, unterdenselben Bedingungen wie vorstehend erwähnt durchgeführt, wobeiein DNA-Fragment, das ein Kanamycinresistenzgen enthielt, erhaltenwurde (etwa 1,5 kb).
    [0098] Die drei Arten von DNA-Fragmenten,die vorstehend erwähntsind, wurden gemischt und als Matrize zusammen mit den in den SEQID NO: 13 und 14 gezeigten Primern einer PCR unterzogen (Reaktionsbedingungen:Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt; ein Zyklus bestand aus den Reaktionsstufender Denaturierung: 94°Cwährend30 Sekunden, des Annealings: 60°Cwährend30 Sekunden, und der DNA-Strangverlängerungsreaktion: 72°C während 4Minuten und 30 Sekunden; dieser Zyklus wurde 25-mal wiederholt),wodurch ein Fragment von etwa 4,2 kb erhalten wurde. Die PCR wurdeauch unter Einsatz der Primer, gezeigt in SEQ ID NO: 9 und 10, unterdenselben Bedingungen durchgeführt,wobei ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 2,0 kb erhaltenwurde. Das Fragment wurde unter Einsatz eines käuflich erwerbbaren Kits (WizardPCR Pregs DNA Purification System, hergestellt von Promega) gereinigtund dann einer Ethanolausfällungunterworfen, und die Präzipitatewurden in TE suspendiert. Diese DNA-Lösung wurde im Folgenden alsFragment fürdie Genzerstörungeingesetzt. Dieses Genfragment hatte eine Struktur, die aus demmetA-Gen bestand, in das ein Kanamycinresistenzgen eingeführt war.
    [0099] Dann wurde das vorstehend beschriebeneGenfragment in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm eingeführt. DasElektroporationsverfahren (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)) wurde fürdie Transformation eingesetzt. Die Zellen wurden nach der Elektroporationauf das SEII-Agarmedium (20 mg/l Kanamycin und 0,5 g/l L-Methioninzugegeben) aufgetragen. Nach 48-stündiger Kultivierung traten mehrereZehn Kolonien auf. Unter ihnen wurden 13 Stämme willkürlich ausgewählt undauf L-Methioninauxotrophie untersucht. Es zeigte sich, dass alleStämmeL-Methioninauxotrophie hatten. Der L-methioninauxotrophe Stamm,der durch die Genzerstörungerhalten wurde, wurde als MR701-Stamm bezeichnet.
    [0100] Die Zerstörung des Zielgens wurde durchdas PCR-Verfahren bestätigt.Das heißt,die vorstehend genannten Kolonien, die auftraten, wurden in 20 μl sterilisiertemWasser suspendiert, mit 5 μl1 mg/ml Proteinase K und 25 μleiner Puffers (40 Millimolar Tris, 0,5% Tween 20, 1% Nonidet P-401 Millimolar EDTA (eingestellt mit HCl auf pH 8,0)) versetzt unddann 20 Minuten bei 60°Cund 5 Minuten bei 95°Cumgesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde als Matrize für die PCReingesetzt. Die PCR wurde unter Verwendung der Sequenzen, die inden SEQ ID NO: 7 und 10 gezeigt sind, als Primer (Reaktionsbedingungen:Es wurde TaKaRa Ex Taq eingesetzt, ein Zyklus bestand aus den Reaktionsstufender Denaturierung: 94°Cwährend30 Sekunden, des Annealings: 60°Cwährend30 Sekunden und der DNA-Strangverlängerungsreaktion: 72°C während 4Minuten und 30 Sekunden; der Zyklus wurde 25-mal wiederholt) durchgeführt, umdie Zerstörungdes Zielgens zu bestätigen.
    [0101] Dann wurde pSEA10, beschrieben inBeispiel 3, in den Stamm MR701, der wie vorstehend beschrieben erhaltenwurde, eingeführt,und die L-Lysinproduktion des Stammes wurde untersucht. pSEA10 wurdein den Stamm MR701 durch Elektroporation eingeführt und die erhaltene Transformantewurde als MR701(pSEA10) bezeichnet. Der Stamm AS1(pSEA10) wurdeauf dem SEII(Sm)-Agarmedium (SEII-Medium, enthaltend 50 μg/ml Streptomycin)ausgebreitet, und der Stamm MR701(pSEA10) wurde auf dem SEII+M(SmKm)-Agarmedium(SEII-Medium, enthaltend0,5 g/l L-Methionin und 50 μg/mlStreptomycin und 20 μg/mlKanamycin) ausgebreitet. Nachdem die Zellen über Nacht bei 37°C kultiviertworden waren, wurden die auf der Zelloberfläche gewachsenen Zellen aufeiner Flächevon etwa 3 cm2 abgeschabt, in das SEII-Produktionsmedium(20 ml), enthaltend 0,075 g/l L-Methionin (50 μg/ml Streptomycin wurden zugegeben),geimpft und 48 Stunden bei 37°Cunter Schüttelnkultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugationentfernt, und die L-Lysinkonzentration in dem Kultur überstandwurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysiergeräts bestimmt(Nikon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie).Es zeigte sich, dass die L-Lysinanhäufung in dem Medium des StammesAS1(pSEA12) 0,97 g/l war, währendder Stamm MR701 (pSEA10) eine L-Lysinanhäufung in dem Medium von 1,52g/l zeigte, so dass bestätigtwerden konnte, dass die L-Lysinproduktion durch Verleihung von L-Methioninauxotrophieverbessert war.
    [Erklärung der SEQUENZLISTE]
    SEQ ID NO: 1: Primer fürdie Amplifizierung der tac-PromotorregionSEQ ID NO: 2: Primer fürdie Amplifizierung der tac-PromotorregionSEQ ID NO: 3: Primer fürdie Amplifizierung des dapA*-GensSEQ ID NO: 4: Primer fürdie Amplifizierung des dapA*-GensSEQ ID NO: 5: Primer fürdie Amplifizierung des lysE-GensSEQ ID NO: 6: Primer fürdie Amplifizierung des lysE-GensSEQ ID NO: 7: Primer fürdie Amplifizierung des metA-GensSEQ ID NO: 8: Primer fürdie Amplifizierung des metA-GensSEQ ID NO: 9: Primer fürdie Amplifizierung des metA-GensSEQ ID NO: 10: Primer fürdie Amplifizierung des metA-GensSEQ ID NO: 11: Primer fürdie Amplifizierung des KanamycinresistenzgensSEQ ID NO: 12: Primer fürdie Amplifizierung des KanamycinresistenzgensSEQ ID NO: 13: Primer fürdie Amplifizierung des Fragments für die Zerstörung des metA-GensSEQ ID NO: 14: Primer fürdie Amplifizierung des Fragments für die Zerstörung des metA-GensSEQ ID NO: 15: Nukleotidsequenz von metASEQ ID NO: 16: Aminosäuresequenz,die von metA kodiert wirdSEQ ID NO: 17: Nukleotidsequenz von lysESEQ ID NO: 18: Aminosäuresequenz,die von lysE kodiert wird.
    SEQUENZLISTE







    权利要求:
    Claims (7)
    [1] Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, welches a)das Kultivieren eines Methanol verwertenden Bakteriums, welchesL-Methionin fürsein Wachstum benötigt undL-Lysin in einem Medium, das Methanol als Hauptkohlenstoffquelleenthält,produzieren kann, b) das Anhäufen von L-Lysin in der Kulturund c) das Gewinnen des L-Lysins aus der Kultur umfasst.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium einMethylophilusbakterium ist.
    [3] Verfahren nach Anspruch 2, wobei das MethylophilusbakteriumMethylophilus methylotrophus ist.
    [4] Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Methylophilusbakteriumderart modifiziert ist, dass die enzymatische Aktivität von Diaminopimelatsynthetaseund ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
    [5] Methylophilusbakterium, welches L-Methionin für sein Wachstumbenötigtund L-Lysin produzieren kann.
    [6] Methylophilusbakterium nach Anspruch 5, welches Methylophilusmethylotrophus ist.
    [7] Methylophilusbakterium nach Anspruch 5, welches derartmodifiziert ist, dass eine enzymatische Aktivität von Diaminopimelatsynthetaseund ein L-Lysinsekretionssystem verstärkt sind.
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    引用文献:
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    法律状态:
    2011-03-17| 8110| Request for examination paragraph 44|
    2012-05-10| R016| Response to examination communication|
    2017-02-08| R016| Response to examination communication|
    2018-10-01| R016| Response to examination communication|
    2018-10-11| R018| Grant decision by examination section/examining division|
    2019-10-25| R020| Patent grant now final|
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
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